Os tumores malignos de pulmão: um estudo italiano, encontra um novo marcador

Artigo Científico

RhoGDI2 suprime metástases do pulmão em ratinhos através da redução de expressão versican tumor e infiltração de macrófagos

Neveen Disse ¹ , Marta Sanchez-Carbayo ² , Steven C. Smith ¹ e Dan Theodorescu ^3, 4

¹ Departamento de Urologia da Universidade de Virginia, Charlottesville, Virginia, EUA. ² Espanhol Instituto Nacional do Câncer (CNIO), Madrid, Espanha. ³ Departamento de Cirurgia e Departamento de Farmacologia da Universidade de Colorado, Aurora, Colorado, EUA. ⁴Universidade de Colorado Comprehensive Cancer Center, Aurora, Colorado, EUA.

Endereço para correspondência: Dan Theodorescu, Departamentos de Cirurgia e Farmacologia e Comprehensive Cancer Center, University of Colorado, 13001 E. 17 º lugar, MS F-434, Aurora, Colorado 80045, EUA. Telefone: 303.724.7135; Fax: 303.724.3162; E-mail:dan.theodorescu @ ucdenver.edu .

Publicado em 12 de março de 2012
Recebido para publicação 10 de outubro de 2011, e aceito em forma de revista 18 janeiro de 2012.

Metade dos pacientes com músculo-invasivo cancro da bexiga desenvolver doença metastática, e este é responsável pela maioria das mortes por este cancro. Baixa expressão de RhoGTP dissociação inibidor 2 (RhoGDI2; também conhecido como ARHGDIB e Ly-GDI) está associada com doença metastática nos pacientes com músculo-invasivo cancro da bexiga. Além disso, uma redução na metástase é observada mediante reexpressão de RhoGDI2 em modelos xenoenxerto de cancro metastático. Aqui, nós mostramos que RhoGDI2 suprime metástase pulmonar em modelos de ratos, reduzindo a expressão das isoformas de V1 e V3 do versican proteoglicano (VCAN, também conhecido como sulfato de condroitina proteoglicano 2 [CSPG2]). Além disso, descobrimos que os níveis elevados versican pressagiava mau prognóstico em pacientes com câncer de bexiga. A importância funcional de expressão de tumor versican na promoção da metástase foi estabelecida in vitro e estudos in vivo em ratos que implicados um papel para a quimiocina CCL2 (também conhecido como MCP1) e macrófagos. Uma análise adicional indicou que RhoGDI2 suprimida metástase, alterando a inflamação no microambiente do tumor. Em resumo, demonstramos o que acreditamos ser um novo mecanismo de supressão de metástase que funciona através da redução respostas de acolhimento que promovem a colonização metastática do pulmão. Terapêutica de segmentação destas interacções pode fornecer uma estratégia adjuvante novo para retardar o aparecimento de metástases clínica em pacientes.

Introdução

Uma metade dos pacientes com cancro do músculo-invasivo (MI) urotelial (UC) da bexiga desenvolvem metástases distantes, mesmo após a cirurgia radical dos tumores primários. Identificamos RhoGTP dissociação inibidor 2 (RhoGDI2, também conhecido como ARHGDIB e Ly-GDI, e abreviado aqui como GDI2) como uma invasão e supressor de metástase em humanos bexiga linhas celulares de cancro ( 1 ) e têm demonstrado que sua expressão é inversamente associado com o clínico resultado após o tratamento de tumores MI (2 ). Independentemente, em perfis de expressão gênica comparativa da bexiga invasivos linhas celulares de cancro humanos e amostras MI UC, identificamos versican (VCAN, também conhecido como sulfato de condroitina proteoglicano 2, [CSPG2]) como altamente expressa em cânceres invasivos e metastáticos (3 ).

Versican é um componente altamente conservada estrutural da ECM que está envolvida no desenvolvimento neuronal ( 4 -8 ), a fase inflamatória da pulmonar-vasculares, aterosclerose (9 -12 ), e as assinaturas invasivo e metastático de muitos cancros (13-25 ). Quatro isoformas ou variantes de splicing foram relatados para versican, e os papéis de V0, V1, V3 e um isoformas e em menor medida V2 são reconhecidos no câncer, doença vascular, e desenvolvimento neuronal (detalhado no refs.8 ,26 ,27 , e as referências aí citadas). Estas isoformas contribuir para estados proliferativas, adesivo, e migratórias de células tumorais e modulam as suas interacções com estroma no microambiente do tumor (26 ,28 ,29 ).

Versican expressão é regulada por citocinas, quimiocinas e hipóxia ( 6 ,7 ,9 -12 ,21 ,26 ,29 -36 ), através de factores de transcrição tais como TCF-4, SP-1, AP-1 e p53, que têm motivos de ligação no promotor versican (5 ,19 ,27 ,36 -38 ). Versican upregulation promotor através de AP-1 é responsável pelos níveis mais elevados de ARNm de expressão observados em células de melanoma humano invasivos (36 ,39 ). TCF-4 tem sido relatado para controlar a expressão de isoformas de versican em células de cancro da próstata (19 ,27 ,38 ).

Aqui, nós demonstrar que acreditamos é um novo mecanismo de supressão metástase, mostrando que a actividade supressora metástase de GDI2 é dependente de uma redução da expressão de versican. Experiências com xenoenxertos de humanos e de murino, no contexto de farmacológica e manipulação genética utilizando ratinhos transgénicos sugerido que ambas as CCL2 e macrófagos foram necessárias para versican para exercer o seu papel de metástases promoção. Acreditamos que este trabalho é a primeira demonstração de um supressor de metástase de tumor do bloqueio da resposta do hospedeiro prometastatic inflamatória em um órgão distante e, em virtude deste facto, destaca o potencial terapêutico de segmentação tanto maligna e derivados do hospedeiro componentes do microambiente do tumor.

Resultados

Versican é um efector putativo do supressor de metástase GDI2. expressão do mRNA reduzido de GDI2 está associado com o resultado clínico pobre em UC (Figura 1 A). Como os relatórios recentes descobriram que a regulação da transcrição pode ser central na metástase a função do gene supressor (40 ,41 ), usamos uma tela de transcrição para identificar efetores putativas de GDI2. Nós comparamos a expressão gênica por microarranjos de alta densidade de oligonucleótidos de baixa GDI2 expressando e altamente metastático UMUC3 células anteriormente (42 ) transfectadas com uma proteína de fusão GFP-GDI2 (GFP) para aqueles abrigando um vector GFP sozinho. Reexpressão de GDI2 nestas células leva a uma redução significativa na colonização metastático do pulmão (42 ).

A Figura 1

GDI2 e versicam expressão e evolução da doença. ( A ) de Kaplan-Meier das curvas que mostram a estratificação de DSS como uma função da GDI2 expressão de RNA em 2 estudos independentes (à esquerda:.. Sanchez-Carbayo et ai, ref 44 ; direita: Kim et al. , ref.46 ). ( B ) de agrupamento Supervisionado de microarray análise de células metastático UMUC3 reexpressing GDI2-GFP e controles GFP foi limitada a 92 sondas significativamente diferencialmente expressos por mais de 3 vezes (à direita). Agrupamento não supervisionado de 92 GDI2 regulamentados sondas em 46 carcinomas uroteliais humanos ( 43 ) (à esquerda). Estágio do tumor é classificado como carcinoma in situ (verde), NMI (laranja) e (preto) MI câncer urotelial de bexiga. Sondas para VCAN mRNA são indicados por setas. ( C ) Os gráficos de pontos de padronizada ( z marcados), registrado expressão (base 2) de sondas VCAN comparando NMI e MI câncer urotelial de bexiga em 4 estudos independentes mostraram (superior esquerdo: Sanchez-Carbayo et al, ref.. 44 ; superior direito : Stransky et ai, ref..45 ; inferior esquerdo: Dyrskjot et al, ref..47 ; inferior direito: Kim et al, ref..46 ). As diferenças nas distribuições foram testadas pelo teste de Mann-Whitney U de teste. ( D ) de Kaplan-Meier mostrando a estratificação de DSS como uma função de expressão VCAN nos mesmos 2 estudos como em A (à esquerda: ref Sanchez-Carbayo et ai,.. 44 ; direita: Kim et al, ref..46 ). Reproduzido com a permissão do Journal of Clinical Oncology ( 44 ), Cancer Molecular ( 46 ),Cancer Research ( 43 ), e Nature Genetics ( 45 ,47 ).

Esta comparação identificados 92 sondas significativamente diferencialmente expressos por um mais do que três vezes a mudança. Dado o papel de GDI2 na supressão de invasão e metástase ( 1 ), restringimos a análise aos candidatos mais significativamente associados com a doença de MI em uma coorte de UCs ( n = 46) perfilado por microarray (ref. 43 e Figura 1B). Utilizando a análise de agrupamento hierárquico para examinar o padrão de expressão destas sondas nos tumores humanos, observou-se o padrão de GDI2-regulados genes relacionados com a fase da doença (Figura 1 B). Curiosamente, versican foi o mais reprimido por reexpressão de GDI2 (mudança de dobragem> de 8 vezes), enquanto sendo o mais significativamente superexpresso em invasiva, em comparação com o cancro não invasivo. Apoiar a noção de que GDI2 reprime expressão versican in vivo, encontramos Uma anti (rho -0,274, P = 0,009) entre GDI2 e expressão de mRNA VCAN em uma coorte completamente separado dos tumores de bexiga humanos ( 44 ).

Também consistente com a noção de que versican pode mediar parte da invasão GDI2 e fenótipo supressor de metástase, encontramos, em 4 grupos distintos de microarranjos de UCs ( 44 -47 ), significativamente maior expressão do RNA de versican em MI em comparação com o músculo não-invasiva (NMI) UCS (Figura 1 C). Em 2 dessas coortes (44 ,46 ), onde a sobrevivência de follow-up dos dados disponíveis, encontramos uma associação significativa entre o nível de expressão de versican e sobrevivência (Figura 1 D). Importante, a expressão de proteína versican em ambas as células tumorais e do estroma de tecidos humanos carcinoma urotelial (Figura 2 A) foi correlacionada com a sobrevivência doença específica pobre (DSS) (Figura 2 B).

A Figura 2

A expressão do VCAN em tumores de bexiga humanos. ( A ) coloração imuno-histoquímica e pontuação de VCAN no MNI ( n = 92) e MI ( n = 102) tumores. Ampliação original, × 100 (painéis superiores); × 200 (painéis inferiores). ( B ) de Kaplan-Meier mostrando a estratificação de DSS para todos os pacientes como uma função do VCAN citoplasmática do tumor (esquerda) e da intensidade do estroma VCAN (direita) de coloração (log rank, P <0,0005 e P = 0,002, respectivamente).

Pulmão metástases e versican expressão in vivo são reduzidos por GDI2 tumor. Expressão de GDI2 em UMUC3 suprimiu significativamente a expressão de V1, V2, V3 e isoformas versican ao nível da transcrição, a proteína celular total, e secreção de proteínas em meio condicionado (CM) (Figura 3 , A e B). Em ensaios de colonização pulmonar, GDI2 reexpressão em UMUC3 colonização reduzida (Figura 3 C) e do número de metástases pulmonares visíveis (Figura 3 D) e diminuiu a expressão de V1, V2, V3 e isoformas versican em depósitos metastáticos do pulmão (Figura 3 E) .

A Figura 3

GDI2 superexpressão reduz metástases pulmonares e expressão VCAN. ( A ) WBS mostrando a expressão da GFP e GFP em células UMUC3. Tubulina Tub. ( B ) A expressão de transcritos VCAN (esquerda) e proteína (à direita) em GFP e GDI2 células foi determinada por qRT-PCR e WB de lisados ​​de células e CM. Barras representam a média ± SEM, n = 3. * P <0,05; ** P <0,01 (comparado com GFP, Student t test). A expressão relativa foi normalizada para o gene GUS de limpeza-B. Carregamento proteína igual foi confirmada por tubulina. ( C ) fardo célula tumoral em pulmões foi determinada por qPCR do cromossoma humano 12p em pontos de tempo indicado após cauda veia-injecção de células cancerosas. Barras representam a média ± SEM, n = 3. * P <0,05, Student t teste, comparando GFP e GDI2. ** P <0,001, 1-way ANOVA com múltiplos de Tukey comparação do teste post-hoc. ( D ) Fotos de pulmão metástase (mets) (circulado em amarelo) e gráfico de dispersão da incidência e número de metástases visíveis 6 semanas após a injeção das células cancerosas. * P <0,05, χ ² de teste, comparando a incidência; ** P <0,01, Student t teste, comparando o número de metástases. ( E ) WB de isoformas VCAN em lisados ​​de pulmão representativos ( n = 3) 6 semanas após a injecção de células cancerosas mostrados na D .

Nós ( 48 ) e outros (49 ) relataram que a infiltração de macrófagos pulmonares é um pré-requisito para o desenvolvimento de metástases pulmonares após cauda veia-injeção das células cancerosas. Uma vez que versican é uma componente da resposta inflamatória do tumor facilitando metástases pulmonares (50 ) e tem sido associada a mediada por macrófagos doença inflamatória vascular (9 ,10 ,12 ,14 ,29 ,38 ,51 -54 ), a hipótese de que GDI2 pode suprimir metástases do pulmão através downregulation de versican, por sua vez conduz a uma redução de macrófagos de pulmão de infiltração. Comparou-se a infiltração de macrófagos dentro e adjacente ao pulmão metastático focos que se desenvolveu após cauda veia-injecção de GFP e GDI2 células e encontraram uma redução em ratinhos injectados com células GDI2 comparado com os controles GFP (Figura 4A). Além disso, os níveis de citocinas-tumor e derivados do hospedeiro (humano e murino hIL-6 e hCCL2, mIL-6, e mCCL2) e COX-2 de actividade, todos os implicados no recrutamento de macrófagos, polarização, e inflamação, foram diminuídas em lisados de GDI2 injectados pulmões (Figura 4 , B e C).

A Figura 4

Metástases pulmonares GDI2-reduzidos são associadas com inflamação pulmonar diminuída. ( A ) imunocoloração Mac2 mostrando infiltração de macrófagos de pulmão em focos metastáticos (circulado em amarelo) e do parênquima pulmonar circundante. Barras representam a média ± SEM de macrófagos contados em 6 campos aleatórios. ** P <0,01, Student t teste. Ampliação original, × 200. ( B e C ) a IL-6 humana (hIL-6), CCL2 (hCCL2), a actividade de IL-6 (mIL-6), e CCL2 (mCCL2), e Cox-2 de murídeo foram determinados em lisados ​​de pulmão. Barras representam média ± SEM. n = 3, realizadas em duplicata. * P <0,05; ** P <0,01, Student t teste. HPF, campo de alta potência.

GDI2 tumor reduz a expressão versican em cancro de células de macrófagos-coculturas. versican é regulada por citocinas e outros factores solúveis no microambiente do tumor ( 50 ). Por isso, é concebível que as citocinas expressas por macrófagos no microambiente do tumor podem estimular a sua própria expressão, bem como versican tumor. Procurou-se determinar o impacto de GDI2 tumor sobre este processo utilizando um sistema de co-cultura de células cancerosas e U937 macrófagos para determinar se tal interacção conduziu a alterações na expressão versican. Cocultura de UMUC3 células com células U937, sem contacto célula-célula, aumentou a expressão de isoformas versican na proteína (Figura 5 A) e os níveis de transcrição (Figura 5B), em ambos os tipos de células, enquanto que a expressão de GDI2 em células cancerosas reduzida versican indução em ambos os tipos de células. Estes achados sugerem GDI2 tumor reduz a expressão de versican em células cancerosas e também exerce um efeito sobre a expressão de macrófagos versican através de células de cancro de secretadas factores.

A Figura 5

GDI2 modula câncer de células macrófagos-interações através de VCAN. ( A ) Esquema de UMUC3-U937 coculturas. WB mostrando a expressão de isoformas VCAN em UMUC3 ou U937 lisados ​​cocultured durante 72 horas. ( B ) qRT-PCR (após 6 horas), em linhas de células sob as mesmas condições que no painel A . Em todos os experimentos co-cultura, barras representam células avaliadas (U937 ou UMUC3) que aparecem abaixo das linhas nos x rótulos do eixo. * P <0,01, em comparação com GFP em uma única célula cultura; ** P <0,01, comparando-GFP e GDI2 em coculturas; ^# P <0,05, comparando-U937 em coculturas único e; ^{# #} P<0,05, comparando-U937 cocultured com GFP e GDI2. ( C ) hIL-6 e hCCL2 em 72 horas CM de culturas únicas de U937 (barras cinzentas) ou UMUC3 (quer GFP ou GDI2, barras pretas) e em coculturas de U937 com UMUC3 (quer GFP ou GDI2, barras brancas). * P <0,05, comparando-GFP e GDI2; ** P <0,01, comparando única célula para co-cultura. ( D ) Cox-2 actividade foi determinada em lisados ​​de células sob as mesmas condições que no Um . * P <0,01, comparando células individuais para coculturas; ^# P <0,01, comparando coculturas com GFP contra GDI2. Student t foi utilizado o teste.

Cocultura de células cancerosas com macrófagos primários ou linhas celulares de macrófagos induz um aumento na citocinas pró-inflamatórias na sua CM ( 48 ,55 ,56 ). Para determinar se GDI2 regula este processo, foi avaliado o efeito de GDI2 em mediadores inflamatórios, em co-cultura, encontrando que GDI2 expressão em células cancerosas diminuiu a secreção de IL-6 e CCL2 citocinas em CM do coculturas (Figura 5 C), bem como Cox-2 actividade (Figura 5 D). Encontramos uma correlação entre a expressão de versican e os outros 2 citocinas na coorte de microarray de tumores de bexiga humanos; este achado suporta a idéia de que existe uma relação entre reguladora IL-6, CCL2 e versican operacional expressão no microambiente do ser humano tumores da bexiga (CCL2, rho 0,514, P <0,001; IL-6, rho 0,537, P <0,001).

GDI2 tumor suprime célula cancerosa e invasão de macrófagos por meio de versican. Nós seguinte determinado o efeito de GDI2 em invasividade célula cancerosa em resposta a qualquer meio de crescimento completo (FGM) ou U937 macrófagos e do papel desempenhado versican neste processo. Knockdown de todas as isoformas versican em UMUC3 (Figura 6 A) phenocopied o perfil de antiinvasive GDI2 células (Figura 6 B). A superexpressão de V1 e V3, mas não V2, isoformas aumentaram UMUC3 invasão matriz (Figura 6 B), enquanto que revoga o efeito antiinvasive de GDI2 reexpressão. Uma vez que a migração transendotelial (TEM) de células de cancro é um passo importante na metástase (48 ,49 ), que investigaram o efeito da GDI2 sobre o câncer de célula TEM (48 ), avaliando a capacidade das células cancerosas para atravessar humanos primários pulmonares microvasculares células endoteliais (PMVEC) monocamadas direção ou CGM ou U937 macrófagos. Reexpressão GDI2 tumor diminuiu a capacidade das células cancerosas para atravessar PMVECs se na presença de CGM ou U937 macrófagos (Figura 1A Suplementar; on-line material suplementar disponível com este artigo; doi: 10.1172/JCI61392DS1 ). Knockdown de versican phenocopied o efeito inibitório do GDI2 em UMUC3 MET. V1 e V3 superexpressão dramaticamente aumentada MET de células GFP para CGM (Suplementar Figura 1A) e células U937 (suplementar Figura 1A), em comparação com os controlos e abrogado o efeito inibitório do GDI2 reexpressão. Em contraste, a superexpressão da isoforma V2 em células cancerosas não tinha nem efeito. Uma vez que as células cancerosas podem exercer um efeito quimiotáctico sobre os macrófagos ( 55 ,57 -61 ), foi investigado o efeito de GDI2 tumor sobre a capacidade das células cancerosas para promover a quimiotaxia de macrófagos através Matrigel ou PMVECs e descobriram que GDI2 reexpressão reduzida U937 migração celular em comparação com os controlos GFP (Figura 1B suplementar). Versican depleção em células tumorais tinham efeitos semelhantes, enquanto V1 e V3 (mas não V2) isoforma expressão em células cancerosas aumentaram a sua capacidade para atrair células U937 (suplementar Figura 1C) e também negada o efeito supressor da GDI2 em U937 quimiotaxia.

A Figura 6

Efeito da manipulação genética de células VCAN em UMUC3 sobre a sua aparência em vitro. ( A ) WB confirmando a eficiência do VCAN knockdown / expressão em UMUC3-GFP e-GDI2 UMUC3 células transduzidas com lentivírus Lentivirus segmentação todas as isoformas de VCAN (sh VCAN), um não-alvo irrelevante (NTsh), ou retrovírus superexpressão V1, V3 e V2 e seus controles vetor vazio (VC). Números representam a densidade relativa normalizada para a banda de tubulina correspondente, com GFP-VC considerado como 1. ( B ) Projetado UMUC3 células em A foram autorizados a invadir Matrigel revestidos 8-mM insere em direção CGM ou U937. * P <0,05. Barras representam a média ± SEM de contadas as células invasoras / atraído de 3 experiências independentes efectuadas em triplicado. Student tfoi utilizado o teste.

A seguir, procurou determinar se essas descobertas podem ser generalizadas para outros humanos linhas celulares de cancro da bexiga e realizaram experimentos adicionais com os humanos da bexiga linhas celulares de cancro em que GDI2 foi originalmente identificado como um supressor de metástase ( 1 ): T24 (não metastático, alta GDI2) e T24T (metastático, baixo GDI2). A manipulação genética de V1 e V3 versican por sobreexpressão e exaustão no T24 e T24T, respectivamente (Figura 2 Suplementar, A, C-), confirmou os resultados obtidos na linha celular UMUC3 (Suplementar Figura 3, A, C-). Em conjunto, estes resultados indicam que o tumor GDI2, através da regulação de V1 e isoformas V3 versican, reduz a capacidade das células cancerosas e macrófagos para invadir matriz e PMVECs.

Versican é necessária para a colonização metastática do pulmão. Com base nas observações acima, a hipótese de que GDI2 mediada por supressão de metástase dependia redução de versican. Para testar esta hipótese, foram comparados shVCAN transduzidas células esgotadas de todas as isoformas (Figura 6 A) com os controlos NTsh em cauda-veia ensaios metástases experimentais, e observaram um decréscimo significativo na incidência e do número de metástases pulmonares (Figura 7 A). A expressão da proteína diminuiu versican foi confirmada para lisados ​​de pulmão shVCAN e foi associado a infiltração de macrófagos e diminuiu mediadores inflamatórios em portadores de tumor pulmões (Figura 7 , B-D). Knockdown de versican em outro metastático linha celular de cancro da bexiga, T24T com expressão GDI2 baixo (ref.1 e Suplementar Figura 2, A e B), revelaram resultados semelhantes (incidência e do número de metástases pulmonares visíveis após cauda veia-injecção de T24T-NTsh controlos e T24T-shVCAN) (suplementar Figura 4A). Além disso, os níveis de versican V1 e expressão da proteína V3 nos pulmões, bem como de infiltração de macrófagos e de mediadores pró-inflamatórios foram similarmente suprimida após knockdown de versican em células T24T (Suplementar Figura 4, B-D).

A Figura 7

Expressão VCAN é necessário para a metástase pulmonar. ( A ) Fotos de pulmão metástase (circulado em amarelo) e gráficos de dispersão mostrando a incidência e número de metástases pulmonares visíveis 6 semanas após a cauda veia-injeção de UMUC3-sh VCAN e controles NTsh. * P<0,01, χ ² teste de comparação de incidência; ^# P <0,01, Student t teste, comparando o número de metástases pulmonares visíveis. ( B ) A expressão de isoformas VCAN em lisados ​​pulmonares foi determinado pela WB menos 6 semanas após a inoculação em amostras de A . ( C ) O número de macrófagos é mostrado e contadas como descrito em Métodos. Barras representam a média ± SEM de o número de macrófagos (6 campos aleatórios). Ampliação original, × 200. * P <0,05, Student t teste. ( D ) A actividade de hIL-6, hCCL2, mIL-6, e os níveis de mCCL2 e Cox-2 em lisados ​​de pulmão. Barras representam a média ± SEM ( n = 3, realizada em duplicado). * P <0,05, Student t teste.

Para determinar se a supressão da expressão versican é necessária para o efeito supressor da metástase GDI2, foi avaliado o efeito da expressão ectópica de isoformas de V1 e V3 em GFP e GDI2 células sobre o desenvolvimento de metástases pulmonares. Nós descobrimos que a superexpressão da V1 e V3 (Figura 8 , A e B) em células GFP foi associada com um aumento na incidência, número e tamanho das metástases pulmonares em comparação com os seus controlos (veículo de controlo [VC]).V1 e superexpressão V3 foi associada com a infiltração de macrófagos aumentada (Figura 8 , C e D) e V1 e expressão da proteína V3 (Figura 9 A), bem como o tumor eo hospedeiro mediadores inflamatórios em portadores de tumor pulmões (Figura 9B). Importante, a reconstituição de V1 e os níveis de V3 em células que expressam GDI2 aos encontrados em células de controlo revogada o efeito supressor da GDI2 em metástases pulmonares, a infiltração de macrófagos e mediadores inflamatórios em portadores de tumor pulmões (Figuras 7 - 9 ). Estes resultados suportam um papel central para tumor derivado V1 e isoformas V3 versican no efeito supressor do pulmão metástase de GDI2.

A Figura 8

Reexpressão de V1 e V3 VCAN atenua RGDI2 efeito supressor metástase. ( A e B ) Gráficos de dispersão mostrando a incidência de número de metástases pulmonares após reexpressão de V1 e V3 em GFP e GDI2 células. * P <0,01, χ ² teste comparando a incidência; ^# P <0,01, Student tteste, comparando o número de metástases visíveis. ( C e D ) O número de macrófagos nos pulmões correspondentes às amostras indicadas em A e B contadas como descrito em Métodos.Barras representam a média ± SEM de o número de macrófagos / HPF. * P <0,05, Student t teste.

A Figura 9

Expressão forçada de V1 e V3 em GFP e GD12 células aumentou de pulmão VCAN e mediadores inflamatórios. ( A ) WB mostrando a expressão de isoformas de VCAN na metástase de rolamento pulmões. ( B ) A actividade de hIL-6, hCCL2, mIL-6, e os níveis de mCCL2 e Cox-2 em lisados ​​de pulmão. Barras representam a média ± SEM ( n = 3, realizada em duplicado).

Bloqueio funcional do eixo CCL2/CCR2 antagoniza versican mediada por metástase pulmonar. Relatórios implicar CCL2 na progressão do cancro e metástases através de seus efeitos sobre macrófagos ( 49 ,58 ,62 ,63 ). CCL2 e expressão versican também são induzidas por fatores comuns in vitro (9 ,10 ,18 ,32 ). Uma vez que os nossos resultados indicam que tanto humana e de murídeo e versican CCL2 no pulmão são reduzidos como uma função de expressão GDI2 do tumor (Figura 4 B e A Figura 7D), nós quisemos saber se os efeitos de prometastatic versican requerem CCL2. Nós usamos 2 abordagens para responder a esta. Em primeiro lugar, utilizou-se um ensaio de metástase singeneico experimental ea MB49 murino bexiga linha de células de cancro (48 ) em CCL2 ( CCL2 ^{- / -} ) ou CCL2 receptor ( CCR2 ^{- / -} ) ratinhos knockout e os seus homólogos C57B6/J6 WT ( 12 ,26,64 ). Em segundo lugar, utilizou-se tanto anticorpos neutralizantes para CCL2 (65 ) e um antagonista de CCR2, RS102895 (66,67 ), em ensaios experimentais, utilizando metástase V1 e V3 versican células isoforma-superexpressão UMUC3.

Encontrámos metástases pulmonares significativamente reduzido (Figura 10 A) e infiltração de macrófagos no pulmão (Figura 10B) na sequência de MB49 injecção cauda veia-in CCL2 ^{- / -} e CCR2 ^{- / -} ratinhos. A falta de acolhimento CCL2, mas não CCR2, foi associada com diminuição da expressão da V1, V2, mas não isoformas de murídeo versican (sem anticorpos anti-V3-específica murino estava disponível) (Figura 10 C), ambos foram ainda associada a uma diminuição em IL-6 e CCL2 (Figura 10 D).Descobrimos também que o bloqueio funcional do CCR2 por RS102895 reduziu significativamente a incidência e número de metástases pulmonares de UMUC3 GFP células basais e sobre superexpressão de V1 e V3 (Figura 10 E); esta descoberta confirma a importância da CCL2. A utilização de um anticorpo para neutralizar CCL2 resultou numa redução semelhante em metástases de células UMUC3 na linha de base e com sobre-expressão de isoformas versican V1 e V3 (Figura 10 F). Estes resultados indicam que o CCL2 e CCR2 são importantes na metástase de pulmão GDI2-versican mediada tanto em modelos murinos e humanos de doença.

A Figura 10

Envolvimento de CCL2 e CCR2 em VCAN mediada por metástase pulmonar. ( A ) Gráficos de dispersão da incidência e multiplicidade de metástases pulmonares após cauda veia-injeção de células murinas MB49 (1 × 10 ⁴ células/100 ul) em CCL2 ^{- / -} e CCR2 ^{- / -} ratinhos WT e os seus homólogos (WT, C57BL / 6). * P <0,05, χ ² de teste, comparando a incidência; ** P <0,01, Student tteste, comparando o número de metástases pulmonares entre WT e CCL2 ^{- / -} aand CCR2 ^{- / -}coortes, 3 semanas após a injeção das células tumorais . ( B ) Mac2 IHC de cortes de pulmão de ratos em um . Barras representam a média ± SEM de o número de macrófagos / HPF. * P <0,05, Student t teste. ( C ) WB de murino V1 (β-GAG) e V2 (α-GAG) em lisados ​​de portadores de tumor de pulmão. ( D ) citocinas murino em WT, CCL2 ^{- / -}, e CCR2 ^{- - /} lisados ​​pulmonares. Barras representam a média ± SEM de 3 experiências independentes realizados em duplicado. * P <0,01, Student t teste. ( E e F ) Gráficos de dispersão da incidência e multiplicidade de metástases pulmonares desenvolvido após cauda veia-injecção de transfectada / transduzidas UMUC3 células em ratinhos nus tratados com antagonista CCR2 RS 102.895 (RS) ea sua VC ou anticorpo neutralizante contra CCL2 humano (anti -CCL2) e isotipo de controlo IgG. * P <0,01, χ ² de teste, comparando a incidência, e Student t teste, comparando o número de metástases pulmonares visíveis.

Depleção de macrófagos inibe versican-driven metástase pulmonar. Nossas descobertas que o efeito supressor de metástase GDI2 é mediada através da modulação de células de câncer de macrófagos interações e regulação baixa de versican nos levou a investigar se o recrutamento de macrófagos contribui para versican mediada por metástase. Primeiro, nós transientemente ablated macrófagos por administração de lipossomas clodronato ( 48 -50 ) e descobriu que a ablação farmacológica dos macrófagos não só reduziu a incidência, número e tamanho das UMUC3-GFP metástases do pulmão, mas também mitigado metástase induzida por sobre-expressão de V1 e V3 (Figura 11 A e A Figura 12 A). Curiosamente, o clodronato não reduzir ainda mais a metástase do pulmão ou infiltração de macrófagos em UMUC3-GDI2 células, enquanto que a infiltração de macrófagos dos pulmões e metástases foi significativamente inibido pelo tratamento de clodronato UMUC3-GFP (Figura 11 B e A Figura 12 B). Os níveis de expressão de hospedeiro e tumor a IL-6 e CCL2, bem como de Cox-2 actividade em portadores de tumor pulmões foram significativamente diminuída após clodronato tratamento (Figura 11 , C e D, e na Figura 12 , C e D).Tomados em conjunto, estes dados argumentam que a infiltração de macrófagos no pulmão desempenha um papel central na GDI2 mediada supressão metástases através downregulation de V1 e isoformas V3 versican.

A Figura 11

Farmacológica depleção de blocos de macrófagos metástases pulmonares V1-driven e inflamação. (A ) Gráficos de incidência e multiplicidade de metástases pulmonares após cauda veia-injecção de V1-expressando GFP e GDI2 células em ratinhos nus tratados com encapsulada em lipossomas clodronato (torrão) ou veículo lipossomas vazios (VPIE). ( B ) As barras são média ± SEM de o número de macrófagos infiltrantes dos pulmões / HPF. * P <0,05, Student t teste. ( C e D ) citocinas humanas e murinas e Cox-2 em lisados ​​de actividade de pulmão de ratos sob as condições experimentais descritas acima. * P <0,05, Student t teste.

A Figura 12

Farmacológica depleção de blocos de macrófagos metástases pulmonares V3-driven e inflamação. (A parcelas) de dispersão da incidência e da multiplicidade de metástases pulmonares que se desenvolveram depois cauda veia-injecção de V3-expressando GFP e GDI2 células em ratinhos nus com e sem tratamento clodronato. ( B ) Barras representam a média ± SEM de o número de macrófagos infiltrantes dos pulmões / HPF. * P <0,05, Student t teste. ( C e D ) citocinas humanas e murinas e Cox-2 em lisados ​​de actividade de pulmão de ratos sob as condições experimentais descritas acima. * P <0,05, Student t teste.

Discussão

Os dados clínicos de doença humana, bem como modelos de roedores experimentais de carcinogênese e metástase revelam que o câncer de bexiga principalmente metástases para os gânglios linfáticos regionais e os pulmões. ( 68 ). A elevada incidência de metástases pulmonares em doentes com cancro foi inicialmente acredita-se ser um processo aleatório, no entanto, relatórios recentes indicaram que o desenvolvimento de metástases pulmonares é provável um processo activo altamente selectivo instigada pela células tumorais e fortemente influenciada pela sua interacção com as células hospedeiras apresentar no microambiente do tumor (69 ). Dado que as metástases são responsáveis ​​pela maioria das mortes por esta doença, a compreensão do presente processo é crítica.

O uso de padrões comuns de expressão do gene entre os modelos da bexiga cancerosas e coortes de tumores de bexiga humana, inferiu-se uma ligação possível entre a expressão GDI2 reduzida e elevada expressão da molécula de ECM versican e pobres resultados clínicos. Especificamente, a relação de expressão de versican e GDI2 para a sobrevivência do paciente, em conjunto com a observação empírica de repressão de versican por reexpressão de GDI2 em linhas celulares de cancro da bexiga sugerido que a sua função supressora de metástase pode depender de uma redução de versican. Relatamos, aqui, que o principal modo de ação da molécula GDI2 metástase supressor é através da redução da resposta do tumor de promoção inflamatória que surgiu recentemente como a marca sétimo de câncer ( 70 ). Utilizou-se complementares farmacológicos e genéticos modelos pré-clínicos e ferramentas in vitro e in vivo para proporcionar uma ligação mecânica entre as associações observadas clínicos de GDI2 para versican e demonstraram a relação causal entre a supressão GDI2 de metástase e redução da versican V1 e expressão da isoforma V3 na vários modelos de câncer de bexiga humano.

Versican é uma molécula complexa ECM e versátil que é indispensável para a vida ( 8 ,29 ). Ele funciona não só como um andaime ou substrato para ser consumida durante tumor de células invasão, mas representa um componente central de cancro relacionada com a inflamação, como se pode ligar múltiplos tipos de receptores de adesão celular, receptores do factor de crescimento, e quimiocinas para fornecer um complexo conjunto de estímulos ambientais para células inflamatórias e câncer em versican ricos em sites (21 ,29 ,71 ). Nosso trabalho demonstrou uma associação entre a expressão de GDI2, versican, e citocinas inflamatórias, tais como CCL2 e revelou que CCL2 expressão de quimiocina foi um factor determinante de metástase versican-driven tumor. Vários estudos têm implicado este quimiocina em inúmeras atividades que tenham impacto sobre a progressão do câncer e metástases (49 ). CCL2 tumor tem sido implicado no recrutamento CCR2 ⁺ células mielóides não só para tumor primário, mas também para potenciais sítios metastáticos, promovendo a sua maturação e diferenciação em um fenótipo inflamatória que estimula o extravasamento, sementeira, e persistente crescimento de células tumorais ( 49 ,56 ,63 ,72 -76 ). De fato, dados recentes demonstram que a segmentação CCL2 com anticorpos inibido de pulmão e metástases ósseas in vivo e pode representar uma nova abordagem para o tratamento do câncer (49 ,63 ,76 ). No entanto, até o nosso relatório, ele não tinha, a nosso conhecimento, foi relatado que hospedam CCL2 é necessário para versican-driven metástase, permitindo a estratificação dos pacientes possível. CCL2 transcrição bem como as vias de sinalização desencadeadas pelo eixo CCL2/CCR2 tem sido mostrada em vários sistemas para ser regulada por NF-kB, e AP-1, quer directamente ou através de outros intermediários de sinalização (63 ,65 ,72 ,73 ,75 -79 ). Assim, pode-se especular que os fatores do microambiente tumoral que desencadeiam estes intermediários de sinalização pode induzir tanto versican e CCL2. Dado que versican promoção de metástases depende anfitrião CCL2, indução paralelo, seria uma vantagem para um tumor de promover ao máximo a colonização metastática.

A associação de GDI2 expressão e desenvolvimento de metástases parece ser tumor do tipo dependente. O efeito supressor metástase de GDI2 no cancro da bexiga foi mostrado para ser influenciada por sua regulação não convencional de RhoGTPases e modificação posttranscriptional ( 42 ,80 ). Curiosamente, em outros tumores, onde esta proteína tem sido estudadas, tais como mama (46 ,81 ) e câncer de cólon (82 ), seus níveis foram diretamente associados com pior prognóstico do paciente.Enquanto os mecanismos de ação da GDI2 nestes cancros não foram completamente elucidados, é concebível que as interações entre GDI2 com seus efetores downstream são influenciados pelo tipo histológico dos tumores. Se de facto a hipótese de que o eixo versican-CCL2-macrófagos descrevemos aqui é crítica para a metástase em vários tipos de tumores, seria de esperar que, nestes cancros, a expressão de GDI2 seria directamente relacionado com o de versican em vez de ser inversamente relacionada como encontramos em tumores de bexiga. Dados preliminares mostraram que este é realmente o caso (Y. Ru e D. Theodorescu, observações não publicadas). A importância deste achado é que ele nos fornece ferramentas para dissecar os tumores dependentes do tipo efeitos pró e antimetastática de GDI2, que já havia sido um problema intratável biológica.

Em conclusão, considerando-se que é importante para versican excrescência das células cancerosas disseminadas, terapeuticamente segmentação versican ou bloqueando as citocinas requeridas para a sua função, tal como CCL2, pode fornecer uma estratégia para atrasar a evolução da doença metastática clínica a partir de depósitos microscópicos. A utilização de anticorpos específicos ou antagonistas de moléculas pequenas contra o CCR2 parece ser uma estratégia promissora anticancerígeno que pode ser especificamente dirigida a alta versican-expressando tumores, optimizando a oportunidade para a resposta clínica.

Métodos

A cultura celular, plasmídeos, transfecções, e transduções virais

Human UMUC3, T24, T24T, humano U937 monocitóides, e murinos MB49 células foram obtidas a partir de e mantido, tal como recomendado pela ATCC. PMVECs foram obtidos a partir de e mantido, tal como recomendado pela Lonza. UMUC3 células que expressam de forma estável GDI2 etiquetado por pEGFP-C1 foram gerados como anteriormente descrito ( 42 ). Knockdown estável de todas as isoformas versican foi feito usando shRNAs V1 5'-CCGGGCCACAGTTATTCCAGAGATTCTCGAGAATCTCTGGAATAACTGTGGCTTTTTG-3 'ou não-alvo shRNA vector de controlo (NTsh), clonado em pLKO.1-Puro (Mission-TRC; Sigma-Aldrich) seguindo o protocolo do fabricante. shRNA foram embalados em células 293T por cotransfecção com plasmídeos de empacotamento compatíveis (Adgene). Sobrenadantes de cultura contendo as partículas virais foram recolhidas 48 horas após a transfecção e filtrada através de filtros de 0,45 iM-(Thermo Fisher Scientific).UMUC3, T24, e as células foram transduzidas com T24T lentivírus contendo sobrenadante na presença de 8 ug / ml de polibreno (Sigma-Aldrich) durante 24 horas. Vírus contendo o meio foi substituído com meio de selecção contendo 1 mg / ml de puromicina (Sigma-Aldrich) por 2 semanas. As células com a knockdown mais eficiente foram utilizados em experiências subsequentes.Human V1 vetor (5 ,83 ), originalmente desenvolvida por Deiter Zimmermann (Universidade de Zurique, Zurique, Suíça), foi clonado num vector retroviral (50 ) e foi um presente de Michael Karin (UCSD, San Diego, Califórnia, EUA), com a permissão de Deiter Zimmermann. V3 vetor retroviral (52 ) e V3 vetor superexpressão foram presentes de Thomas Wight (Coração Esperança Programa de Biologia Matrix, Benaroya Research Institute at Virginia Mason, em Seattle, Washington, EUA). Vetor de expressão V2 foi um presente de Burton Yang (University of Toronto, Toronto, Ontário, Canadá). Transfecção do plasmídeo, a transdução virai, e selecção de antibiótico de linhas de células estáveis ​​foram realizadas como descrito anteriormente (50 ,52 ,84 ,85 ).

Em experimentos in vivo

Feminino atímicos (nu ⁺ / nu ^{+ de} camundongos), 4 a 6 semanas de idade (Instituto Nacional do Câncer), foram tratados seguindo as diretrizes aprovadas da Animal Care and Use Comissão da Universidade de Virginia. Para metástase experimental, as células cancerosas foram injectados na veia lateral da cauda ( 48 ). Os ratinhos foram sacrificados em pontos de tempo indicado após injecção, quando os pulmões foram retirados, e do número de metástases superfície visível foi contado. Tecidos ou foram processados ​​para imuno-histoquímica (IHQ) ou snap-congelado para análises moleculares (48 ). Para as experiências terapêuticas, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em grupos que receberam clodronato encapsulado em lipossomas nanopartículas (5 mg / ml) ou lipossomas vazios como anteriormente descritos (48 ) antes de cauda veia-injecção de células cancerosas. Para as experiências de metástases singeneicas, 5 - a 6 semanas de idade CCL2 ^{- / -} e CCR2 ^{- / -} ratinhos WT e os seus homólogos (C57B6/J6) foram obtidos de Jackson Laboratories e recebeu uma injecção cauda veia de 1 × 10 ⁴ MB49 células/100 uL de vermelho de fenol livre RPMI 1640. Os ratinhos foram sacrificados após 3 semanas, e metástases pulmonares foram enumerados. Em alguns experimentos, os camundongos nus foram injetados com UMUC3 células com superexpressão de V1, V2 e V3 isoformas humanas e foram randomizados em grupos que receberam anticorpos neutralizantes para CCL2 humano (MAB679, R & D Systems) ou mouse controle IgG (10 mg / rato) injetados intraperitonealmente cada 4 dias a partir da data de inoculação de células de tumor ( 65 ). CCR2b inibidor pequena molécula RS102895 foi dado a cada 4 dias a 10 mg / kg por gavagem oral (66 ,67 ). Os ratinhos foram sacrificados 6 semanas após a injecção de células tumorais. Os pulmões foram extraídos e do número de metástases visíveis foi quantificado.

Quantitative PCR em tempo real

Fardo de células de tumor foi determinada através da quantificação cromossoma humano 12p em ADN genómico em pulmões do rato como descrito anteriormente ( 48 ). Isoformas versican foram detectados em células e tecidos por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR). O ARN foi isolado utilizando Kit RNeasy (QIAGEN) e transcrição inversa com Superscript III Kit (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Iniciadores utilizados para amplificar isoformas versican foram descritos anteriormente (86 ). qPCR foi realizada utilizando o SYBR Green PCR Master Mix e Bio-Rad iCycler (Bio-Rad). A expressão relativa foi normalizada para o gene Gus housekeeping-B.

Anticorpos e Western blots

Os anticorpos humanos específicos versican incluem o seguinte: policlonal de coelho anti-humanos V0/V1 e V0/V2 anticorpos (Thermo Fisher Scientific). O anticorpo anti-versican 12C5, que reconhece o domínio N-terminal em V3, foi obtido a partir do Developmental Estudos Hybridoma Bank (Universidade de Iowa, Iowa City, Iowa, EUA). Anticorpo policlonal de coelho anti-versican anticorpos que detectam proteínas de ratinho incluem o seguinte: V1 (β-GAG) e V2 (α GAG-) (ABD Serotec). GDI2 anticorpo foi comprado de Primavera Bioscience. Anticorpos Mac-2 e F4/80 foram adquiridos da BD Biosciences e Serotec ABD.Anticorpo monoclonal de ratinho contra α-tubulina foi da Sigma-Aldrich. Os anticorpos monoclonais contra humano MCP-1/CCL2 (MAB679) e controle de isotipo IgG eram de R & D Systems e Coulter, respectivamente.

Immunoblotting

Monocamadas confluentes de células cancerosas humanas da bexiga foram cultivadas em placas de 6 poços, soro-starved em meio isento de soro (SFM) durante a noite, e deixou-se condição durante 72 horas. Em algumas experiências, as células foram cocultured com U937 (1 × 10 ⁶ células / ml SFM) e adicionado a 0,4 mícrons Transwell câmaras (Costar; Corning) sem contacto célula-célula directa. CM foi recolhido e eliminado por centrifugação. As células em câmaras superior e inferior foram colhidas em tampão de lise (20 mM Tris, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaF 50 mM, desoxicolato de sódio a 0,5%, 1% de NP-40, 1 mM de Na ₃ VO ₄ , e 1 × protease mistura cocktail inibidor). Tecidos pulmonares tumor-rolamento e de controlo foram pulverizadas em tampão de lise e clarificado por centrifugação a 12.000 g durante 20 minutos a 4 ° C; concentrações de proteína foram determinadas pelo ácido bicinconínico (BCA) ensaio (Pierce; Thermo Fisher Scientific). Células e de tecidos lisados ​​e CM foram resolvidas por 4% -20% de SDS-PAGE, transferidos para membranas de PVDF (Bio-Rad), e sondado com os anticorpos indicados.Para a detecção de V3 isoformas, lisados ​​de células e de tecidos foram tratados in vitro com 0,4 U / ml condroitinase ABC (ChABC) em acetato de sódio 100 mM, pH 8,0, durante 1 hora a 37 ° C, fervida durante 10 minutos na redução de desnaturação tampão Laemmli , clarificado por centrifugação, e submetido a Western Blot (WB), utilizando o anticorpo anti-versican 12C5.Detecção da proteína foi realizada utilizando HRP-anticorpos secundários conjugados e SuperSignal Femto sensibilidade máxima de substrato (Pierce).

Ensaios de microinvasão e TEM

Os ensaios de invasão e quimiotaxia foram realizados como descrito anteriormente ( 48 ,56 ,78 ). PMVECs foram cultivadas até à confluência em 3 - e 8 m de poro filtros em placas de 24 poços e ensaios de MET de células U937 e as células cancerosas foram realizadas como descrito anteriormente (48 ,56 ,78 ).

Determinação da actividade CCL2, IL-6, e Cox-2

Kits comerciais de ELISA foram utilizados para determinar as concentrações de humano e murino IL-6 e CCL2 (RayBiotech. Inc.).Os kits de imunoensaio enzimático para a COX-2 actividade (Cayman Chemical Inc.) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante.

Construção e imunomarcação de bexiga de tissue microarray câncer

Padrões de expressão de proteínas versican foram avaliados através de 2 tissue microarray (TMA) ( 87 ,88 ). Antigénio de recuperação de métodos (0,01% de ácido cítrico durante 15 minutos sob tratamento por microondas) foram utilizados antes da incubação com anticorpo anti-rato versican monoclonal (Lifespan BioSciences) com 1:400. Condições de coloração foram otimizados em seções de formalina fixas, incluídos em parafina testículo como controle positivo, tal como recomendado pelo fabricante. A ausência de anticorpo primário foi utilizado como um controlo negativo. Os anticorpos secundários (Vector Laboratories) foram biotinilados cavalo anti-ratinho (1:500 de diluição). Diaminobenzidina foi utilizada como o cromogénio final e hematoxilina como o contracorante nuclear (48 ,87 ,88 ). O valor de consenso dos 3 ou 4 núcleos representativos de cada amostra de tumor vestida foi utilizado para análises estatísticas. Expressão versican foi avaliada no tumor e no estroma.Versican coloração no estroma circundante do tumor foi categorizado como negativo (-), de baixo (+), intermediário (+ +), e alta (+ + +). Pontos de corte de expressão para avaliação prognóstica foram selecionados com base nos valores médios de expressão entre os grupos em análise. Para a pontuação do tumor, "elevada" foi designada como coloração mais do que 10% das células tumorais. Para estromal versican, a presença de qualquer coloração foi designado como "elevada."

Estatística

Homem de dados expressão gênica de perfil. Duplicar isolados de mRNA de GFP ou reexpressing GDI2 UMUC3 células ( 42 ) foi avaliado para a expressão do gene usando Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 microarrays como descrito anteriormente (2 ).Microarray foram apresentados dados (GEO GSE35014). Normalizados de log ₂ valores de expressão foram extraídos por RMA implementado em MATLAB versão R2010B (MathWorks). Para comparação com coortes de tumores humanos, os conjuntos de dados usados ​​incluíram Sanchez-Carbayo et al. ( 44 ) ( n = 26 e 65, para NMI e doença MI, respectivamente), Stransky et al. (45 ) ( n = 16 e 14 para NMI e doença MI, respectivamente), Kim et al., GSE13507 ( 46 ) ( n = 103 e 62 para NMI e doença MI, respectivamente), e 2 estudos de Dyrskjot et al. , GSE3167 e GSE89 ( 43 ,47 ) ( n = 33 e 13 para NMI e doença MI, respectivamente; n = 62 e 9 para NMI e doença MI, respectivamente). Os dados processados ​​foram baixadas do NCBI GEO e / ou um suplemento de publicação on-line ( 44 ,45 ). Para visualização, casos do Dyrskjot (47 coorte) foram agrupadas por expressão de GDI2 regulamentados sondas diferencialmente expressos entre MNI e casos MI em MATLAB, utilizando a distância euclidiana e da ligação média. O coeficiente de correlação (rho) para correlação de classificação com base em Spearman de expressão de genes indicados foi usado onde indicado.

Para planejar, registrar ₂ dados para testes individuais foram padronizadas ( z marcados) antes de plotar os valores de NMI e tumores MI em Prism 5.0 (GraphPad Software), testando as diferenças nas distribuições pelo teste de Mann-Whitney U teste. No HG-U133 Affymetrix plataforma, onde existem múltiplas sondas para VCAN , log ₂ dados para sondas foram padronizados ( zmarcados), em seguida, em média. Para Kaplan-Meier análise da relação entre a expressão de VCAN e DSS, log-rank testes de diferenças de DSS por classe de expressão gênica (expressor alta ou baixa) foram realizados em MATLAB. As curvas apresentadas DSS usar pontos de corte no ponto ideal discriminante para a estratificação de sobrevivência, com log-rank Pvalores mostrados. A força relativa da associação de GDI2 ou VCAN expressão para a sobrevivência foi ainda testado em multivariados de Cox modelos de regressão de risco proporcional, também em MATLAB.

IHC. Associação de versican expressão com o estágio do tumor foi avaliada por meio de Wilcoxon-Mann-Whitney e Kruskal-Wallis ( 87 ,88 ). Associações com DSS (DSS) foram avaliados usando o teste log-rank. Tempo DSS foi definida como os meses decorridos entre a ressecção transuretral ou cistectomia e morte da doença. As curvas de sobrevida foram plotados usando Kaplan-Meier, metodologia e análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote estatístico SPSS (IBM), versão 18,0 (48,87 ,88 ).

Salvo disposição em contrário, todos os outros dados foram analisados ​​estatisticamente por 2-tailed Student t teste, 1-way ANOVA, e χ ² testes quadrados usando o Microsoft Excel 7.0 e GraphPad Prism 5 para Windows (GraphPad Software). As diferenças foram consideradas significativas em P <0,05.

Aprovação do estudo

Todos os experimentos com animais foram realizados após a aprovação do protocolo e em conformidade com as diretrizes da Atenção Animal e Uso Comissão da Universidade de Virginia. TMAs câncer de bexiga foram construídos no National Cancer Institute espanhol ( 87 ,88 ). Estas matrizes incluídas primários carcinomas uroteliais da bexiga pertencentes a pacientes recrutados ao abrigo do Conselho de Revisão Institucional de aprovados protocolos; pacientes deram o consentimento informado em estudos referenciados (87 ,88 ).Uma equipe de cientistas ' IEOS-CNR em Nápoles foi capaz de confirmar o papel chave do gene cbx7 em muitos casos de tumores pulmonares malignos. O estudo, cujos resultados foram também publicados noThe Journal of Clinical Investigation , foi capaz de demonstrar que mecanismos similares subjacentes câncer no homem e identifica ciclina E como um possível alvo terapêutico. No passado, outros investigadores tinha encontrado uma série de provas científicas já sugerido que a cbx7 gene supressor de tumor tinha um cuja ausência ou mutação que está associado com numerosos casos de tumores malignos. Mas agora, com o trabalho coordenado por Alfredo Fusco , diretor do Instituto de Endocrinologia e Oncologia Experimental do National Research Council (IEOS-CNR) em Nápoles, obteve a confirmação final. O projeto foi financiado pela "Associação Italiana de Pesquisa do Câncer (AIRC).

O estudo conduzido por pesquisadores dell'Ieos-CNR em Nápoles - "Utilizando um modelo experimental, foi demonstrado que a ausência de cbx7 determina o desenvolvimento de adenomas e carcinomas de pulmão", diz Fusco. "O mecanismo atrás destes tumores envolve, ciclina E, uma proteína cuja expressão é regulada negativamente por cbx7. O aspecto importante da nossa pesquisa está mostrando que mecanismos semelhantes aos identificados em modelos experimentais são também a base para o desenvolvimento de carcinomas de pulmão humanos. Na verdade, mesmo em tais neoplasmas é detectado é o aumento da expressão de proteína chamada ciclina E, que promove o crescimento de células de ciclina E-, e à ausência de expressão de cbx7 ".

Alguns genes desempenham um papel no desenvolvimento de tumores - Estes resultados são parte de um experimental all'Ieos-CNR já começou nos anos 80. "Nosso grupo está trabalhando em proteínas longas chamadas HMGA ( Grupo de Alta Mobilidade A ) que foram isoladas em colaboração com a "Universidade de Trieste ", diz o diretor de IEOS-CNR, que também é professor na ' Universidade de Nápoles " Federico II " . "Estas proteínas são encontradas no núcleo das células, regulam a expressão de muitos genes e desempenham um papel crucial no desenvolvimento de tumores: a sua expressão é particularmente elevada em tumores mais agressivos com prognóstico pobre e curta da sobrevivência de pacientes, enquanto ' supressão da sua expressão conduz ao bloqueio de transformação do tumor. "

Recentemente, o grupo mostrou que essas proteínas interagem com HMGA cbx7 que, surpreendentemente, se comporta de uma maneira oposta: a sua expressão é reduzida em tumores da tireóide, cólon e pâncreas, e falha ocorre na maioria dos cânceres invasivos e sobrevida reduzida. "No entanto, para validar o papel da comunidade científica chamado para confirmação em modelos experimentais, cuja caracterização tem sido o assunto da recente publicação do trabalho forte e entusiástica de muitos jovens pesquisadores", diz Fusco."Assim, esses estudos indicam cbx7 como um excelente marcador para o diagnóstico e prognóstico do câncer de pulmão e outros órgãos, e identificar ciclina E como um possível alvo terapêutico no câncer de